蛋白质、多肽等的荧光标记方法

 

荧光标记物与蛋白、多肽等的结合方式可分为两大类：共价键结合和非共价键结合。

共价键结合是指荧光标记物与蛋白、多肽等分子通过共价化学键的方式相结合的标记方法。荧光标记物和这些被结合的物质含有可共价反应的活性基团,被结合物质上的活性基团主要有氨基、琉基、羟基以及梭基等，荧光标记物上的活性基团主要有异硫氰酸酯（SCN）、马来酰亚胺（MAL）、N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）等。

常见的共价结合反应主要有以下几种：

（1）氨基的标记反应

 N端氨基或赖氨酸广泛存在于在蛋白质或多肽中,他们很易与活化的酯类发生反应。N-羟基琥珀酰亚胺是近年来常用的衍生试剂。它可与异氰酸酸（FITC）等发生此类结合。

 （2）巯基的标记反应

  蛋白质中半胱氨酸含有自由的琉基,是蛋白质中最活泼的反应基,它可以和不太活泼的活化试剂反应。巯基在中性条件下就可以反应,因而在氨基存在时,巯基可以选择性地与目标分子偶联。除了胱氨酸和半胱氨酸外,甲硫氨酸有时可以与巯基活化试剂反应，如碘乙酰胺类、马来酰亚胺类等。

 （3）其他标记反应

  多肽、蛋白等大分子上的活性基团还有羟基、羧基、羰基等。羟基化合物的衍生试剂主要有磺酞氯类标记物等；羰基化合物的衍生试剂主要是含有肼基或氨基的化合物；羧基化合物的衍生试剂主要有重氮甲烷类和哌嗪类荧光标记物。

  非共价结合荧光标记通常是指荧光标记物与被结合分子通过物理作用方式相结合,如核酸探针与DNA的结合方式等。共价结合后形成的荧光复合体更稳定,此反应为特异性反应,经常用于蛋白质或小分子的定量分析。而非共价结合反应仅能用于核酸与蛋白质等大分子的定性检测,免疫荧光分析等,较少用于小分子的定量分析。